Test in vitro e test in vivo - parte I

Oltre ai test per la valutazione della tossicità acuta e di quella di lungo periodo, vi sono anche altri aspetti che vanno presi in considerazione, come la cancerogenesi, la mutagenesi e la teratogenesi, ovvero gli effetti sui feti.
Così come già visto per la valutazione della cancerogenicità, anche mutagenesi e teratogenesi vanno approfondite tramite test specifici da svolgersi anch'essi in laboratorio.
Alcuni test sono su cavie, cioè su organismi con tutte le proprie funzionalità correttamente operanti, capaci cioè di assorbire, metabolizzare o detossificare una sostanza attiva. Altri test sono in vitro, cioè su colture cellulari. Vengono cioè isolate e fatte sviluppare delle "colonie" di cellule in appositi contenitori, arricchiti con un liquido ove siano presenti elementi nutritivi. Poi vengono aggiunte le molecole che si vogliono testare.

Mentre per la teratogenesi sono ovviamente necessarie cavie vive e vegete, e pure gravide, per la mutagenesi si utilizzano normalmente test in vitro. In questa prima parte si approfondirà il tema della teratogenesi, lasciando alla seconda parte quello della mutagenesi.
 

I test per la teratogenesi

Questi test, come detto, vengono effettuati su femmine gravide, per lo più di ratto, di topo o di coniglio, al fine di individuare gli eventuali effetti sui feti in termini di malformazioni di qualsivoglia natura. Queste vengono nutrite per un determinato lasso temporale con alimenti che contengono dosi crescenti di sostanza attiva. Oppure vengono sottoposte a un trattamento "one shot", tutto in una volta sola, posizionato in una finestra temporale prestabilita durante la gravidanza. Solitamente, la fase di massimo sviluppo relativo del feto.

Anche in questo caso si avranno dei risultati diversi in funzione della dose applicata. Si otterranno cioè dei valori a cui la teratogenesi non si verifica, fino a trovarne uno in cui tale effetto viene invece misurato.

A causa della difficoltà di stima di tale parametro - analogamente a quanto accade per la cancerogenesi - nemmeno relativamente alla teratogenesi è prevista alcuna NOEL, come avviene invece per la valutazione della tossicità di lungo periodo sull'organismo tal quale. Ciò implica che un prodotto rivelatosi teratogeno in laboratorio, anche se a dosi astronomiche, verrà classificato come tale e presenterà in etichetta le famigerate frasi H361 (Sospettato di nuocere alla fertilità o al feto) oppure H360 (Può nuocere alla fertilità o al feto).
La scelta della frase dipende dal grado di confidenza con il risultato ottenuto.

Tali frasi sono più o meno il corrispettivo della vecchia R63 (può provocare danni ai bambini non ancora nati), la frase di rischio che ha causato in passato diverse estromissioni di agrofarmaci dai disciplinari di produzione integrata.

Il limite di confidenza per la teratogenesi viene cioè posto pari a zero, generando alcune conseguenze negative in materia di comunicazione di massa. Questo approccio lascia infatti adito a interpretazioni molto libere da parte dei non addetti al settore - e a volte anche nel settore stesso, purtroppo - perché in tal caso non si tiene conto di un parametro importantissimo per stabilire un qualsiasi tipo di rischio: l'esposizione al prodotto stesso.
Ogni effetto è legato infatti a una dose: se una molecola mostra per esempio una tossicità acuta molto bassa, va da sé che nei test di teratogenesi si riesce a salire molto con la dose, arrivando così in alto che, prima o poi, qualcosa pur succede. Al tossicologo tanto basta. Lui deve solo trovare un valore al quale si annota un effetto. Non è compito suo stabilire se è ragionevole pensare che quel valore sia raggiungibile in realtà dall'uomo oppure no. Purtroppo, in tal modo si generano anche dei mostri dove di mostri non ve ne siano affatto.

La legislazione corrente non prevede, né si pensa prevederà mai in futuro, un'Adi (Acceptable daily intake) per la teratogenesi. E a parere di chi scrive è un peccato, perché ciò non permette di colmare il profondo scollamento che sussiste fra profilo tossicologico di laboratorio ed effettivo livello di rischio per l'uomo. Molto dell'allarmismo disinformativo sugli agrofarmaci poggia purtroppo proprio su questo.
 

Il caso hymexazolo

All'inizio degli anni 2000, a chi scrive, fu dato di seguire il processo di registrazione in Italia di un nuovo agrofarmaco, l'hymexazolo, la cui soglia per la teratogenesi stallava alcune migliaia di volte al di sopra dell'Adi ricavato dalla specifica NOEL. Data la conoscenza dei residui finali di questo prodotto nelle colture, ottenuti da prove in campo ad hoc, fu possibile calcolare che una donna di 50 chili non potesse assorbire con la dieta più di un centomilionesimo (1 : 100.000.000) della dose che in laboratorio era risultata innocua sui feti. Innocua, non teratogena.

Detta in altri termini, non vi era alcun rischio reale per le donne fertili derivante dalla teratogenicità mostrata in laboratorio da quella sostanza attiva, da utilizzarsi per giunta nella concia dei semi di barbabietola da zucchero. Nonostante ciò, quel prodotto fu "marchiato" con la cupa frase di rischio R63 con tutte le conseguenze commerciali del caso.
Da un punto di vista puramente tossicologico ciò è insindacabile: sali e sali con la dose e la teratogenesi alla fine pur si verificò e venne quindi correttamente registrata. Da un punto di vista pratico, invece, quella frase aveva ben poco senso, perché nella realtà quel prodotto non si avvicinerà mai nemmeno lontanamente alle soglie di pericolosità evidenziate dai tossicologi lavorando su cavie gravide.

L'apposizione della frase di rischio in etichetta andava quindi benissimo in senso normativo. Fu semmai la reazione ad essa a risultare priva di fondamento, come spesso accade.
 

Il caso benomyl

Una conseguenza di tale approccio, avulso da calcoli sul rischio reale, si palesò sul finire degli anni '90, quando DuPont fu condannata in America a versare alcuni milioni di dollari a una bracciante che aveva partorito un bambino con delle malformazioni agli occhi. Mentre era incinta aveva infatti lavorato in un frutteto come raccoglitrice di agrumi e questi erano stati protetti con benomyl, fungicida ormai bandito da decenni.

Purtroppo per DuPont, quel fungicida aveva mostrato in laboratorio effetti teratogeni, portando le cavie a partorire cuccioli con malformazioni proprio agli occhi. Essendo una sostanza attiva praticamente atossica (LD50 > 10.000 mg/kg), era stato possibile applicarla alle cavie gravide a dosi di grammi. Un'esposizione stellare, una vera e propria inondazione di benomyl che ha portato, come visto, a quell'effetto indesiderato.

La giuria non esitò però a correlare quel test di laboratorio con la sventura capitata a quella bracciante e condannò la multinazionale a versare un cospicuo indennizzo. Buon per la bracciante e per suo figlio, ma corre l'obbligo di pensare che la dose cui era stata sottoposta lei era calcolabile come alcuni milioni di volte inferiore a quella risultata innocua in laboratorio. Innocua, non teratogena.
Tradotto, se benomyl fosse stato solo un po' più tossico in chiave acuta, non si sarebbe forse mai potuta registrare teratogenesi. 

Peraltro, sul fungicida corrono alcune narrazioni dai Paesi d'Oltrecortina come la Russia. Negli anni '70-'80, all'epoca della CCCP, i prodotti per l'agricoltura erano considerati necessari, quindi costavano pochissimo. Lo zucchero, invece, era considerato voluttuario, quindi costava molto.

Nelle campagne sovietiche si narra quindi che molte famiglie di agricoltori utilizzassero il formulato commerciale, composto per il 50% da zucchero, per dolcificare cibi e bevande, perché la sostanza di per sé era innocua se ingerita. Un livello di esposizione stratosferico. Eppure, nulla è mai stato riportato in termini epidemiologici a carico della popolazione sovietica, inclusi gli aspetti della teratogenesi. Sarà forse leggenda. Sarà forse esagerazione. Ma tale narrazione appare in effetti alquanto suggestiva e dovrebbe indurre ad alcune attente riflessioni.
 

Il caso talidomide

Per due casi in cui la teratogenicità è stata misurata in laboratorio, penalizzando molecole di fatto innocue nella realtà, ve n'è uno in cui tale effetto non venne debitamente approfondito e la sostanza attiva causò danni gravissimi alla popolazione, ovvero la talidomide.

Lanciata verso la metà degli anni '50, questa sostanza attiva andò a sostituire i barbiturici nei trattamenti alle donne gravide come sedativo e anti-nausea. Peccato che i test svolti sulla molecola non fossero stati sviluppati su cavie in maniera abbastanza scrupolosa, permettendo il lancio sul mercato di un medicinale apparentemente innocuo, ma foriero di effetti nascosti mai valutati.

I primi casi di malformazioni fetali, ovvero l'incompleta formazione degli arti, nota anche come focomelia, vennero registrati nel 1957, ma solo nel 1961 vennero resi pubblici i primi studi che correlavano tale farmaco alle malformazioni. Peccato che in quel lasso di tempo siano stati riportati mille e 500 casi. Finalmente, nel 1961 venne sperimentato il farmaco su animali da laboratorio gravidi, confermando gli effetti teratogeni. Il 2 dicembre del 1961 la talidomide venne ritirata in Gran Bretagna, subendo poi lo stesso destino negli altri Paesi. In Italia il ritiro avvenne nel settembre 1962. Un sollievo per colui che scrive, concepito nel 1963 e nato nel 1964.

In quel caso, l'esposizione umana raggiungeva facilmente quella a cui si erano manifestati gli effetti teratogeni. Solo che prima di vendere quel medicinale nessuno si era preso la briga di valutare né la prima, né i secondi.

I tre casi sopra riportati possono quindi fare concludere in primis che gli studi di laboratorio sulla teratogenesi sono utilissimi e che vanno condotti quindi con il massimo scrupolo. Perché quando vi è una lacuna sperimentale in tal senso i danni poi divengono gravi e diffusi.

Altra conclusione che si può trarre, però, è che manca ancora la volontà di interpretare correttamente proprio quei dati, acquisendoli spesso in valore assoluto senza prendersi la briga di sviluppare alcuna valutazione dei rischi reali derivanti dall'esposizione umana. Un'esposizione massima tollerabile la quale, ovviamente, andrebbe calcolata adottando coefficienti di riduzione ad altissimo grado di prudenza.

Ci si ricordi di ciò alla prossima bottiglia di vino che stapperete, magari senza sapere ancora se siete o meno in stato interessante. Perché l'alcol è uno dei peggiori teratogeni esistenti fra i cibi e le bevande normalmente utilizzate (il loghino con il divieto per le donne gravide è ormai d'obbligo su ogni alcolico). Eppure nessuno ne chiede il bando, come avviene invece per altre classi chimiche.

Qualche domanda su tali dicotomie interpretative, prima o poi, bisognerà certo porsela.

---