L'embriogenesi somatica: un valido strumento di risanamento da virus in vite

Le malattie virali costituiscono, com'è noto, un grave problema patologico per molte specie di interesse agrario, tra le quali la vite.

Non esistendo ad oggi la possibilità di effettuare direttamente trattamenti in campo per mancanza di fitofarmaci antivirali validi, il principale metodo di lotta preventiva è la diffusione di materiale di propagazione sano. Quando non sia possibile reperire in natura biotipi esenti almeno dalle virosi più importanti (come ad esempio avviene di frequente nel caso di vitigni di antica coltivazione in zone ristrette e su un limitato numero di ceppi) o quando un certo biotipo sia interessante per molti aspetti ma non possa essere avviato alle procedure di selezione clonale perché affetto da una o più virosi, diventa necessario procedere al risanamento artificiale. I metodi comunemente utilizzati per ottenere il risanamento di viti affette da malattie virali sono la termoterapia e la coltura di apici meristematici; negli ultimi anni, però, l'embriogenesi somatica si sta dimostrando uno strumento di grandi potenzialità 'sanitarie', sebbene di non semplice applicazione.

Com'è noto, l'embriogenesi somatica consiste nella differenziazione di embrioni da tessuti di diversa origine, quali foglie, parti del fiore immaturo, internodi, ecc. In vite questo avviene in modo indiretto, mediante la formazione di callo (callogenesi) e la successiva differenziazione degli embrioni (embriogenesi). Da tali embrioni si sviluppa una pianta intera con un processo molto simile a quello proprio dell'embrione zigotico. L'embriogenesi somatica è ampiamente utilizzata, per la vite e per moltissime altre specie, per la rigenerazione a partire da cellule sottoposte a trasferimento genico; embrioni somatici possono altresì essere usati come espianti da sottoporre a crioconservazione e come potenziale fonte di variabilità somaclonale.

Il fatto che piante derivate da embrioni somatici di vite potessero risultare esenti dai virus presenti nelle piante madri da cui erano stati prelevati gli espianti era già stato notato da un gruppo di ricercatori sudafricani all'inizio degli anni '90, che avevano osservato però un'efficacia limitata a solo alcuni virus, in particolare virus floematici. Alcuni anni più tardi, anche grazie alla disponibilità di efficaci protocolli di rigenerazione per molte specie e cultivar, la tecnica è stata applicata con successo a Citrus, canna da zucchero e cacao.

Il gruppo di ricerca dell'Istituto di virologia vegetale (Ivv) del Cnr di Grugliasco (To) da alcuni anni sta effettuando ricerche, non solo sull'efficacia dell'embriogenesi somatica come metodo di risanamento da virus della vite, ma anche sui meccanismi attraverso i quali si esplica tale effetto. Il risanamento da virus quali Grapevine leafroll-associated virus-1 e -3 (Glrav-1 e Glrav-3), Grapevine virus A (Gva) e Grapevine fleck virus è risultato sempre del 100% in tutte le prove eseguite, su centinaia di linee ottenute da embrioni somatici. Inoltre, questa tecnica ha permesso di ottenere pieno successo nel risanamento da Grapevine rupestris stem pitting-associated virus (Grspav), virus per il quale le tecniche tradizionali (coltura di meristemi, termoterapia in vivo e in vitro) applicate in precedenza avevano portato a percentuali di risanamento non superiori al 29%. Per quanto riguarda il Grapevine fanleaf virus (Gflv), un nepovirus che invade con relativa facilità i meristemi, il risanamento è stato possibile nel 98% circa dei casi, mentre precedenti risultati ottenuti nel 1992 nella Repubblica Sudafricana evidenziavano la necessità di applicare un periodo di termoterapia agli espianti iniziali per ottenere il risanamento da Gflv.

Per spiegare i differenti risultati è stato ipotizzato che nel nostro caso la maggiore concentrazione di fitoregolatori nei substrati utilizzati possa aver contribuito all'eradicazione del virus, anche se le conoscenze sugli effetti di citochinine ed auxine esogene sui virus sono poche e non esaustive. Un protocollo analogo a quello da noi seguito è stato recentemente utilizzato da un gruppo di ricerca austriaco che ha ottenuto l'eliminazione dell'Arabis mosaic virus, un altro nepovirus, nel 100% degli embrioni somatici derivati da viti infette.

Sezione di callo di vite dopo ibridazione in situ per la rilevazione di Gflv: il colore blu indica la presenza dell'Rna virale.

A fronte di ottimi risultati nel risanamento, rimanevano però molte domande sui meccanismi che lo inducono durante il processo di rigenerazione. E' stata quindi studiata la presenza di Grspav, Glrav-1 e Gva in vari stadi delle colture embriogeniche di vite mediante Rt-Pcr. Mentre i virus erano sempre presenti negli espianti iniziali, dopo 4 mesi di coltura il 65% dei calli era ancora infetto da almeno un virus e dopo 8 mesi non era possibile rilevare la presenza dei virus in alcuno dei calli esaminati. Nessuno degli embrioni somatici e delle viti da essi ottenute risultava infetto, neppure dopo ambientamento e anni di coltura in serra. Risultava anche che la rigenerazione di embrioni sani avveniva quando parte dei calli era ancora positiva ai saggi virologici. In un secondo studio è stata valutata in parallelo la distribuzione di Gflv, Glrav-3 e Gva in calli embriogenici, mediante ibridazione in situ con sonde oligonucleotidiche marcate con digossigenina. Mentre per il Gflv dopo 4 mesi di coltura era possibile osservare un mosaico di cellule infette e di cellule non infette, con forti concentrazioni del virus in alcuni gruppi di cellule in zone periferiche del callo, Gva e Glrav-3 erano in genere presenti in poche cellule circondate da aree di cellule libere da questi virus. Dopo 6 mesi di coltura, calli ed embrioni risultavano essere liberi dai virus. I risultati ottenuti hanno quindi confermato la diversa capacità da parte dei virus in esame di diffusione nei calli e comunque l'efficacia di questo metodo di rigenerazione per l'eliminazione dei virus.

Indubbiamente la rigenerazione per embriogenesi somatica ha grossi vincoli (i tempi lunghi, la forte dipendenza dal genotipo, la trueness-to-type delle piante rigenerate da accertare) che ancora non le permettono di affiancarsi alle tecniche tradizionali di risanamento nelle applicazioni di routine. In compenso presenta, a nostro parere, un grande interesse dal punto di vista scientifico, mostrando di essere potenzialmente il metodo più efficace per ottenere una vite totalmente virus-esente; in tal senso, si tenga conto che i saggi virologici riguardano in genere i virus più importanti, ma la vite è la coltura agraria in cui è stato identificato il più alto numero di agenti patogeni virali. Speriamo con questa nota di stimolare contributi e un proficuo confronto su questo argomento nell'ambito del Gruppo di lavoro Soi 'Micropropagazione e tecnologie in vitro'.

A cura di Ivana Gribaudo e Giorgio Gambino dell'Istituto di virologia
 vegetale - Cnr, Unità di
 Grugliasco (Torino)