Conservazione dei semi in azoto liquido: per la salvaguardia della biodiversità vegetale

I semi delle specie vegetali vengono tradizionalmente conservati in banche del seme, in camere fredde mantenute alla temperatura, in genere, di –18°/-20°C. In conservazione, la longevità del seme dipende da fattori intrinseci ed estrinseci e, inoltre, da meccanismi di protezione e riparazione dai danni eventualmente prodotti dalle basse temperature.

A secondo del comportamento dei semi sottoposti a disidratazione vengono distinti tre gruppi: semi tolleranti alla disidratazione (semi ortodossi), semi intermedi (semi sub-ortodossi) e semi sensibili alla disidratazione (non ortodossi o recalcitranti).

I semi ortodossi, che vanno incontro ad una naturale riduzione del contenuto in acqua già sulla pianta madre, possono essere disidratati fino ad avere un contenuto in acqua anche inferiore al 10%, senza che ne venga compromessa la vitalità e la germinabilità. La conservazione a bassa temperatura di questi semi, opportunamente disidratati, può quindi essere protratta per tempi molto lunghi (anche per decenni). I semi non ortodossi o recalcitranti non entrano in dormienza e sono metabolicamente pronti a geminare quando ancora sulla pianta madre; quindi, a differenza dei semi ortodossi, non vanno incontro ad una naturale disidratazione prima della maturazione. Per la conservazione, i semi non ortodossi devono essere raccolti ad un ben preciso stadio di maturità, spesso di breve o brevissima durata. I tempi di conservazione sono comunque sempre molto limitati, in quanto questi semi hanno, a maturità, un contenuto in acqua che oscilla fra valori del 35% e del 90%, sono molto sensibili alla disidratazione artificiale e perdono facilmente la loro vitalità già quando il contenuto in acqua scende sotto il 30%. 

Per quanto sopra, la crioconservazione di semi interi o embrioni escissi rappresenta un valido strumento per la conservazione a lungo termine del germoplasma di specie a propagazione gamica, caratterizzate da semi sub- o non-ortodossi. La crioconservazione permette di conservare il materiale vegetale in condizioni di temperatura ultra-bassa per tempi illimitati. La conservazione viene effettuata con organi e tessuti vegetali immersi in azoto liquido, cioè alla temperatura di -196°C, oppure mantenuti nei suoi vapori, a circa -160°C. A queste temperature non si ha alcuna attività biochimica cellulare e, di conseguenza, è bloccata la crescita biologica e lo sviluppo degli organi o tessuti, senza che ne sia compromessa la sopravvivenza.

I semi, prima dell'immersione in azoto liquido, devono essere opportunamente ridotti nel loro contenuto in acqua a valori, in genere, inferiori al 25%. La disidratazione viene condotta mediante esposizione dei semi per tempi definiti sotto il flusso d'aria sterile di una cappa a flusso laminare, oppure in contenitori ermeticamente chiusi, contenenti gel di silice o una soluzione acquosa satura di un sale potassico (acetato, idrossido o carbonato di potassio). La conservazione in azoto liquido si opera ponendo i semi in crioprovette da 2 cc (cryovials) che vengono, a loro volta, inserite in scatole di plastica da criogenia (cryoboxes). Le scatole vengono quindi impilate all'interno di appositi contenitori per azoto liquido. Dopo il recupero dall'azoto liquido e lo scongelamento in bagno termostatato, i semi sono posti a germinare in vitro. In questa fase, la coltura in vitro svolge un importante ruolo, in quanto la scelta del substrato più idoneo e l'applicazione di opportune condizioni di coltura (temperatura, illuminazione e fotoperiodo) possono favorire la germinazione dei semi sopravvissuti alla crioconservazione e il primo sviluppo dei semenzali.

E' da rilevare che la crioconservazione dei semi si presta, oltre che alla conservazione di specie a propagazione gamica, anche alla conservazione clonale di specie da frutto caratterizzate dalla contemporanea presenza nel seme dell'embrione zigotico e di embrioni nucellari. E' questo il caso del genere Citrus, all'interno del quale si annoverano molte specie poliembrioniche. In tal senso, una recente applicazione della crioconservazione ha riguardato lo studio condotto dal Cnr-Ivalsa di Sesto Fiorentino (Fi) su un'antica collezione medicea di agrumi, svolto in collaborazione con la Soprintendenza speciale per il patrimonio storico, artistico ed etnoantropologico e per il Polo museale della città di Firenze.

Lo studio ha permesso di sviluppare un'idonea procedura di crioconservazione per numerose accessioni della collezione di Citrus della Villa Medicea di Castello in Firenze. La collezione, iniziata da Cosimo I° de' Medici nel XVI° secolo, comprende oltre 600 accessioni di elevato valore storico, la maggior parte delle quali mantenute in grandi conche di terracotta. Il progetto, sviluppato grazie anche ad un finanziamento dell'Ente cassa di risparmio di Firenze, si basa sulla determinazione, per ogni accessione, del contenuto in acqua del seme più appropriato a garantirne il mantenimento della germinabilità durante l'immersione diretta e la conservazione in azoto liquido. I semi, subito dopo il prelievo, sono privati del tegumento esterno e decontaminati mediante immersione in etanolo (al 70%, v/v in acqua) per 5 minuti, successivo trattamento in ipoclorito di sodio (al 2%, peso/v in acqua) per 15 minuti e lavaggio finale con acqua sterile.
Il seme originariamente ha un contenuto in acqua del 40-50%, a seconda delle accessioni. Viene pertanto disidratato ponendolo sotto flusso d'aria sterile, fino a portarlo ad un contenuto in acqua inferiore al 25%, e successivamente immerso direttamente in azoto liquido all'interno di cryovials. Dopo scongelamento, la germinabilità è valutata ponendo i semi in scatole Petri contenenti substrato MS, addizionato di 146 mM di saccarosio e 0.5 g/l di estratto di malto, a pH 5.7. I semi sono poi mantenuti a 26±1°C e in oscurità per una settimana e successivamente trasferiti in fotoperiodo 16h (40 μmol m-2 s-1). Trascorsi 21 giorni, si provvede a trasferire le plantule in contenitori di plastica da 80 cc.

Ad oggi, il progetto ha permesso di sviluppare un idoneo protocollo di disidratazione e immersione diretta in azoto liquido per 14 antiche accessioni, provenienti da 9 specie di Citrus e da un ibrido; per 11 di queste è stata ottenuta una germinabilità superiore al 75% dopo recupero dall'azoto liquido. Obiettivo primario del progetto è la duplicazione in criobanca della collezione di agrumi Medicea, primo esempio applicativo in Italia di crioconservazione di semi. Oltre gli agrumi, presso il Cnr-Ivalsa è stata in questi anni oggetto di indagine anche la conservazione in azoto liquido del seme di Pistacia spp. e di embrioni escissi di arachide (Arachis hypogaea). Sono inoltre in corso prove sperimentali di crioconservazione di semi di specie forestali (Fagus sylvatica, Abies alba, Pinus cembra, Prunus avium), in collaborazione con il Centro nazionale biodiversità forestale di Peri (Vr).

La principale criobanca del seme è oggi presso il National center for genetic tesources preservation di Fort Collins, Colorado, ove sono conservati a -18°C e in crioconservazione semi di oltre 750.000 specie vegetali.

A cura di Anna De Carlo - Cnr-Ivalsa, Sesto Fiorentino (Fi)