La capacità di piante e microalghe di sintetizzare un'ampia gamma di metaboliti primari e secondari rende questi organismi dei veri e propri bioreattori naturali. Il loro impiego come tali è stato reso possibile grazie alla nascita delle biotecnologie vegetali e all'evoluzione di tutte le discipline ad essa correlata, come l'ingegneria genetica e metabolica, che hanno reso queste piattaforme fotosintetiche utilizzabili in diversi settori, tra cui quello farmacologico, cosmetico ed industriale.
Da questa considerazione nasce la presente tesi magistrale, incentrata sull'incremento di sintesi di molecole bioattive, i triterpeni, in organismi vegetali transgenici, quali piante di tabacco e microalghe. I triterpeni rappresentano nelle foglie delle piante circa il 5% del peso secco, e fino al 40% in alcune microalghe. Figurano tra i principali costituenti delle resine, degli oli essenziali e degli ormoni stimolatori della crescita, e data la loro spiccata attività antinfiammatoria, antivirale e anticancerogena offrono interessanti applicazioni nel campo nutraceutico e farmacologico.
Inoltre, al contrario della normale struttura lineare, è l'ottenimento di forme cicliche di tali composti terpenici che sarebbe particolarmente interessante, infatti, in forma ciclica, ad anello, offrirebbero caratteristiche chimico-fisiche simili a quelle dei combustibili, e quindi potenzialmente impiegabili come biocarburanti, con un impatto ambientale minore rispetto all'utilizzo dei classici carburanti derivanti da fonti non rinnovabili.
Per la realizzazione di questo studio, l'espressione in piante e microalghe della Triterpene ciclasi, enzima responsabile della ciclizzazione di triterpeni lineari, è stata effettuata sfruttando l'Agrobacterium tumefacens, che si annovera tra i metodi più impiegati per il trasferimento di Dna nel genoma di organismi fotosintetici. Pertanto, il vettore binario utilizzato (pG0029-CaMV35S::AsOXA1) è stato inserito tramite elettroporazione all'interno dell'agrobatterio.
In figura è riportato il vettore 35SOXA1 contenente il gene AsOXA1, isolato dalla pianta erbacea Aster sedifolius e codificante per una ß-amirina sintasi, enzima chiave coinvolto nel pathway di ciclizzazione dei triterpeni, posto sotto il controllo del promotore costitutivo 35S.
Rappresentazione schematica del vettore di espressione pG0029- 35SCaMV::AsOXA1
(Fonte: Vittorio Manca)
L'avvenuta integrazione del gene eterologo (AsOXA1) nelle microalghe e piante di tabacco saggiate è stata verificata mediante analisi molecolari (PCR), riscontrando dati promettenti:
- su 12 specie algali impiegate, ne sono state ottenute con successo 5 transgeniche, tra cui Chlamydomonas reinhardtii, una delle alghe unicellulari più conosciute ed utilizzata come specie modello in numerosi studi sperimentali sin dalla fine del XIX secolo.
Microalghe transgeniche inoculate su substrato solido
(Fonte: Vittorio Manca)
- per quanto riguarda le piante di tabacco: dei 51 espianti trattati, oltre l'80% ha mostrato formazione di callo e ha differenziato in germogli transgenici.
Germogli di tabacco transgenici in crescita su substrato solido
(Fonte: Vittorio Manca)
I tessuti vegetali transgenici ottenuti sono stati infine sottoposti ad analisi di misura dell'espressione del gene eterologo tramite Real Time PCR, e i risultati hanno mostrato valori di espressione incrementati con un range compreso tra 1.0 a 2.4 (log), indicando quindi una maggiore occorrenza di ciclizzazione delle molecole terpeniche.
Pertanto, i dati ottenuti confermano una possibile ingegnerizzazione del pathway di sintesi dei triterpeni - ad oggi ancora non completamente noto - in piante e microalghe, aprendo la strada a nuove applicazioni biotecnologiche in campo farmaceutico, nutraceutico e per la produzione di biocombustibili.
Nel prossimo futuro, interessante sarebbe l'approfondimento degli studi nell'ambito dell'ingegneria metabolica delle molecole terpeniche, data l'elevata efficienza nell'impiego di questi organismi fotosintetizzanti come bioreattori rispetto ad altri modelli. Per tale motivo, gli organismi transgenici ottenuti nel presente lavoro di tesi verranno sottoposti ad ulteriori analisi quali Hplc e spettrometria di massa per la caratterizzazione del profilo dei triterpeni e la loro quantificazione.
Vittorio Manca, categoria "Innovazione varietale e genomica"
(Fonte: Vittorio Manca)
Scarica la tesi completa di Vittorio Manca
Per eventuali contatti: vittorio.manca95@gmail.com
A cura di Vittorio Manca
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