Ricco di vitamine e di sostanze antiossidanti, come il beta carotene e il licopene, il pomodoro (Solanum lycopersicum L.) apporta numerosi benefici alla salute umana rendendolo un alimento essenziale nella dieta mediterranea.
Tuttavia però non tutti possono beneficiare di questi vantaggi: molti consumatori infatti sviluppano allergie dovute alla presenza di specifiche proteine chiamate "Sola", la cui nomenclatura deriva appunto dalla famiglia delle Solanacee.
Ridurre o eliminare questo potenziale rischio potrebbe valorizzare ulteriormente le proprietà benefiche della bacca. E per raggiungere questo obiettivo, il genome editing, come la tecnologia Crispr/Cas9, può affiancare il tradizionale miglioramento genetico.
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L'applicazione di Crispr/Cas9 su Solanum lycopersicum è stato oggetto di uno studio condotto da Maria Dellino, assegnista di ricerca post dottorato del gruppo di Cinzia Montemurro e Claudio De Giovanni, professori del Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti dell'Università di Bari "Aldo Moro", e di Antonio Richart Granel professore dell'Istituto di Biologia Cellulare e Molecolare della Pianta dell'Università Politecnica di Valencia.
AgroNotizie® ha quindi intervistato la ricercatrice per approfondire il funzionamento, i vantaggi ma anche le sfide di questa innovativa tecnica genetica.
Allergie e proteine, il potenziale dell'editing genomico
Ad oggi sono state identificate circa 26 proteine Sola, incluse le loro isoforme, cioè molecole che hanno la stessa funzione della proteina principale ma con una diversa conformazione tridimensionale.
"Io mi sono occupata della Thaumatin like protein (Tlp), di cui ancora non è stata caratterizzata del tutto la sua funzione. Appartiene alla famiglia delle Patogenesis Related Protein, in particolare al gruppo cinque e che sia coinvolta anche nei sistemi di difesa della pianta contro gli stress biotici e abiotici. - spiega Maria Dellino - E della poligalatturonasi (PG2a), un enzima coinvolto nella degradazione della pectina della parete cellulare, e quindi nei meccanismi di maturazione del frutto".
Come può la tecnologia Crispr/Cas aiutare a diminuire le reazioni allergiche? In pratica, andando a eliminare o abbassare l'espressione della proteina allergenica, inducendo a monte il silenziamento del gene coinvolto nella sua espressione.
Infatti Crispr, attraverso il sistema di "taglia e cuci", induce una mutazione nel gene target, rendendolo di fatto non funzionale. Di conseguenza, la proteina finale risulta alterata o potrebbe non essere prodotta affatto, con potenziali effetti benefici per il consumatore finale.
Mutazioni nei geni: risultati promettenti
Quali sono stati i risultati ottenuti fino ad ora con il silenziamento dei geni target Tlp e PG2a?
La dottoressa Dellino ha ottenuto nella generazione T1 alcuni pomodori mutati e senza il gene Cas (Cas free). Quindi di fatto piante diverse dal pomodoro wild type usato come controllo, e senza geni estranei nel loro Dna. Il passaggio successivo è stato poi quello di valutare in silico, cioè con una simulazione al computer, se le proteine finali prodotte dai pomodori editati fossero "tronche", ovvero con una struttura differente dalle normali proteine allergeniche.
"Abbiamo effettivamente confermato che le mutazioni hanno prodotto dei codoni di stop prematuri che interrompono la normale sequenza del gene; quindi, ci aspettiamo a questo punto una proteina non funzionale. Nel mio caso ho dimostrato effettivamente l'efficienza del sistema Crispr/Cas9, ma chiaramente questa è una predizione in silico".
I pomodori editati in vitro svolgono tutto il loro ciclo in serra
(Fonte: Maria Dellino)
Difatti il prossimo passo per la ricercatrice sarà svolgere uno studio più approfondito di proteomica per vedere dove si interrompe la loro sequenza amminoacidica. In poche parole, si deve dimostrare che la proteina sia effettivamente diversa e che quindi non scateni fenomeni indesiderati nel consumatore.
"Lo scopo finale del nostro lavoro è anche quello di svolgere dei piccoli test cutanei per valutare proprio la risposta allergenica" specifica Dellino.
Poiché questo argomento potrebbe sembrare complesso a prima vista, senza entrare troppo nei dettagli tecnici, esaminiamo il procedimento che consente di ottenere i pomodori editati.
Dal gene target alla generazione T1
Lo studio è partito usando la cultivar 'Moneymaker' di Solanum lycopersicum che viene normalmente utilizzata dai ricercatori per la trasformazione genetica.
Innanzitutto, si svolge la fase in silico, che ricordiamo è una simulazione al computer, in cui si sceglie il gene target da editare, in questo caso l'allergene, e di cui bisogna conoscere la sequenza.
Poi si disegna l'opportuno Rna guida, ovvero una sequenza di 20 paia di basi complementare ad una regione del gene target, che è fondamentale per l'editing genetico, perché permette alla Cas9 di tagliare esattamente in quella regione.
"Per il primo gene, cioè per la Thaumatin like protein, ho scelto per esempio due Rna guida che avessero un basso off target, per far si che gli Rna guida non andassero a complementarsi con altre regioni del genoma. Successivamente ho assemblato il vettore di clonaggio, contenente gli Rna guida, il gene Cas9 e il gene che conferisce resistenza alla kanamicina, che viene usato per trasportare gli Rna guida e il gene Cas9 all'interno della pianta" continua Dellino.
La resistenza all'antibiotico kanamicina viene usata come marcatore per selezionare solo le piante trasformate nella fase del vitro.
Infine, il costrutto viene inserito all'interno di Agrobacterium tumefaciens che funge da veicolo fisico per "infettare" le cellule vegetali e fare avvenire la trasformazione genetica. Da qui in poi si passa alla fase in vitro, costituita da diversi step e in cui si ottiene la generazione T0, che di fatto sono i pomodori trasformati (e selezionati tramite la resistenza alla kanamicina).
Rigenerazione dei calli in vitro di pomodoro dopo la trasformazione genica con Agrobacterium tumefaciens
(Fonte: Maria Dellino)
"Sulla generazione T0 sono andata ad effettuare la genotipizzazione e con un software chiamato Synthego ho visto tutte le sequenze nucleotidiche mutate di una specifica linea di pomodoro. In poche parole, ho guardato se si sono create delle mutazioni, perché può succedere che la Cas9 non tagli e allora la sequenza della linea rimane identica a quella del pomodoro usato come controllo".
Dopo aver completato la genotipizzazione della generazione T0, si tengono solo i pomodori con un'elevata percentuale di editing per proseguire con la fase in vivo, ovvero l'allevamento in serra. Qui si raccolgono i semi dalla generazione T0, che daranno origine a una nuova progenie: la generazione T1. Su questa viene eseguito uno screening genetico per distinguere le linee che hanno mantenuto il gene Cas da quelle che lo hanno perso durante la formazione dei gameti.
"Da una generazione all'altra non ci aspettiamo che tutte le linee perdano il gene Cas. Qualcuna però l'abbiamo trovata in omozigosi senza Cas, e queste sono le piante ideali e interessanti da portare avanti. - entra nel dettaglio Dellino - È anche presente una quota a parte di pomodori che hanno mutazioni in eterozigosi con ancora il gene Cas, queste linee non vengono abbandonate, ma servono per continuare la segregazione nella successiva generazione T2".
La situazione ideale alla fine di tutto il procedimento sarebbe quella di ottenere un alto numero di pomodori mutati e Cas free. In questo modo, oltre a studiare l'effettivo miglioramento della qualità della bacca, si potrebbero portare avanti altri studi. Come, per esempio, valutare la risposta della pianta agli stress ambientali.
Editare sì, ma occhio al resto
È bene sottolineare che nel pomodoro c'è ancora tanto da esplorare sulle funzioni di queste 26 proteine.
Una cosa però è certa: molte di queste non solo causano problemi nell'uomo ma, come anche detto dalla ricercatrice, svolgono nella pianta delle specifiche funzioni, come quelle difesa dagli stress ambientali.
"Per quanto sia bello editare i geni non sappiamo se la pianta sopravvivrebbe rimuovendo tutti gli allergeni, perché chiaramente ognuno di questi ha magari un ruolo fondamentale nel pomodoro. - specifica Dellino - Invece andando a rimuoverli uno alla volta e vedendo singolarmente l'effetto sulla pianta potrebbe aiutarci a capire non solo il ruolo specifico di queste proteine, ma anche comprendere come si comporta nei confronti degli stress".
Comprendere meglio questi meccanismi potrebbe essere utile per ottimizzare caratteristiche di resilienza, offrendo così vantaggi concreti anche agli agricoltori.
Fasi chiave e benefici delle Tea
Come abbiamo visto le fasi per ottenere pomodori editati e anallergici sono diverse, e alcuni passaggi sono più delicati di altri come predire il più correttamente possibile l'efficienza dell'Rna guida scelto, inserire il sistema Crispr/Cas9 nel costrutto, la rigenerazione e la crescita degli espianti in vitro e l'acclimatazione delle piantine in serra.
In generale però i vantaggi nell'applicare le Tecniche di Evoluzione Assistita in agricoltura sono molteplici perché si potrebbe migliorare la resistenza e/o la tolleranza agli stress e la qualità nutraceutica degli alimenti.
Per esempio, andando anche a sovra esprimere l'azione di un gene e non solo a diminuirne o eliminarle la funzione: "Nelle cultivar per l'aspetto qualitativo si potrebbe non solo ridurre il contenuto di sostanze anti nutrizionali ma anche migliorare e aumentare il quantitativo di proteine. Quindi di composti nutrizionali positivi per l'uomo".
Inoltre, si ridurrebbero le tempistiche per costituire nuove varietà o migliorare quelle già esistenti rispetto alle metodologie tradizionali.
"Secondo me le Tea rappresentano un grande vantaggio. Sono delle biotecnologie che in poco tempo ti permettono di vedere grandi risultati, di studiare i geni e di osservare i loro effetti a 360 gradi. Penso però, e questa è una mia opinione, che bisogna sempre avere la consapevolezza delle potenzialità sia positive ma anche negative della tecnica" conclude Dellino.
