Tra i fattori biotici che colpiscono il pomodoro (Solanum lycopersicum), la picchiettatura e la maculatura batterica hanno una grande importanza economica perché, compromettendo la qualità dei frutti, sono responsabili di gravi perdite di produzione.
Gli agenti causali della picchiettatura batterica sono la razza 0 e la razza 1 di Pseudomonas syringae pv. tomato. La resistenza alla razza 0 è conferita dal gene Pto: piante che possiedono il gene Pto sono resistenti, mentre quelle prive di tale gene sono suscettibili alla malattia. Attualmente, non vi sono varietà coltivate resistenti alla razza 1 ma tale resistenza è stata identificata nelle varietà selvatiche di pomodoro, come S. lycopersicoides. Nella linea di introgressione LA4245 è infatti presente una porzione del cromosoma 4 di S. lycopersicoides, in cui è situato il locus Ptr1, responsabile della resistenza alla razza 1 del patogeno.
L'agente eziologico della maculatura batterica è un complesso di quattro specie di Xanthomonas. Il locus responsabile della resistenza a X. euvesicatoria è Rx3 e collegato ad esso si trova il marcatore Rx3-L1. Nelle varietà di pomodoro commerciali non è stata ancora identificata una resistenza efficace nei confronti di X. vesicatoria, mentre, la resistenza a X. perforans è conferita dal locus Rx-4, il cui marcatore più vicino è pcc12.
Lo sviluppo di varietà di pomodoro resistenti alle malattie è uno degli obiettivi principali del miglioramento genetico di questa specie. Pertanto, lo scopo di questa tesi è stato identificare marcatori molecolari che potessero essere coinvolti nella resistenza alla picchettatura e alla maculatura batterica.
Le 55 accessioni di pomodoro identificate sono state allevate e successivamente inoculate con gli agenti patogeni P. syringae pv. tomato razza 0 e razza 1, X. euvesicatoria e X. vesicatoria (Fig. 1). In seguito sono stati osservati i sintomi su ogni foglia e ne è stato riportato il grado di severità, utilizzando la scala di Horsfall & Barratt.
Fig. 1 Sintomi visibili di infezione da Xanthomonas vesicatoria su una replica biologica dell'accessione Isi_13
In un secondo momento, presso l'azienda Isi Sementi situata a Fidenza (Pr), sono state eseguite analisi di Pcr e Hrm (Fig. 2) (tramite primer reperiti in bibliografia o disegnati ad hoc) sul Dna estratto dalle stesse accessioni di pomodoro infettate.
Per ogni accessione è stato quindi confrontato il risultato fitopatologico con il dato molecolare, ricercando una eventuale correlazione tra risposta al patogeno e genotipo ottenuto con i marcatori molecolari. Il confronto tra la gravità dei sintomi rilevati e i dati molecolari ottenuti con i marcatori Rx3-L1 e pcc12 non ha evidenziato correlazioni tra il genotipo e il fenotipo osservato, mentre, i risultati ottenuti con il marcatore Pto hanno confermato la sua associazione con il fenotipo resistente (Tab. 1). Fanno eccezione due accessioni che, pur possedendo genotipo omozigote suscettibile, si sono rivelate resistenti, probabilmente per la presenza di ulteriori fonti di resistenza.
Fig. 2 A) Curva Hrm normalizzata relativa al marcatore Pto; B) Curve di dissociazione generate dall'analisi dei campioni sottoposti a Pcr, utilizzando il marcatore Pto
Tab. 1 Confronto tra la media della gravità dei sintomi e i genotipi risultanti dall'analisi Hrm, utilizzando il marcatore Pto, per ciascuna accessione. Le accessioni sono ordinate in base alla severità dei sintomi (in verde = bassa/nulla severità; in rosso = suscettibilità)
Per la resistenza alla razza 1 di Pseudomonas, sono state scelte come riferimento le due accessioni di pomodoro sulle quali, in fase di valutazione del test fitopatologico, è stato registrato il valore più basso di gravità di sintomi e quello più alto. Di queste due accessioni sono stati confrontati i dati della genotipizzazione (già in possesso dell'azienda) e, all'interno della regione di introgressione, sono stati scelti sette Snp che fossero polimorfici tra le due. Mettendo insieme i dati molecolari ottenuti utilizzando tutti e sette gli Snp, è stato evidenziato un aplotipo che corrisponde al genotipo resistente, condiviso da tre marcatori utilizzati su sette (Tab. 2). In base alla posizione di questi tre SNP, è stato possibile ipotizzare che la regione coinvolta nella resistenza alla razza 1 si trovi tra 55047 kb e 55738 kb.
In conclusione, dai test fitopatologici sono stati ottenuti dati preliminari utili per mettere a punto le metodologie di infezione. Inoltre, tutti i marcatori utilizzati per la resistenza alle specie di Xanthomonas testate, a prescindere dall'associazione con il fenotipo, hanno mostrato un buon grado di discriminazione dei genotipi, pertanto, potranno essere usati per altri scopi quali il fingerprinting molecolare.
Un risultato positivo è stato la riconferma dell'associazione tra il marcatore Pto e il fenotipo resistente; inoltre, è stata ipotizzata la presenza di ulteriori fonti di resistenza.
Infine, è stata individuata la probabile posizione della regione di introgressione coinvolta nella resistenza alla razza 1 di Pseudomonas. In futuro sarà utile aumentare il numero di campioni da testare e saturare la zona con altri marcatori.
Valentina Orofino, categoria "Difesa delle colture"
(Fonte: © Valentina Orofino)
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A cura di Valentina Orofino
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