Silenziamento genico: ottenere resistenza a peronospora in vite

Le NBTs rappresentano un'importante opportunità per il settore vitivinicolo. Roberta Gravagno è la vincitrice dell'AgroInnovation Award 2020 nella categoria "Innovazione varietale e genomica" - tesi magistrali

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Agroinnovation Award è il premio di laurea che promuove la diffusione di approcci innovativi, strumenti digitali e l'utilizzo di internet in agricoltura

Il silenziamento genico è un meccanismo molecolare che permette di disattivare l'espressione di un gene prima della sua traduzione nella proteina corrispettiva sfruttando l'azione di molecole di Rna a doppio filamento capaci di inibire o sopprimere l'espressione di un gene. Tali molecole di Rna non codificano per alcuna proteina ma esercitano un controllo su quegli Rna che invece codificano per proteine, cioè l'Rna messaggero (mRna). Le lunghe molecole di Rna a doppio filamento vengono processate dall'enzima dicer la cui azione porta alla formazione di molecole di Rna a doppio filamento più corte, gli short interfering Rna (siRnas). Questi si legano al complesso Risc che recluta uno dei due filamenti di Rna e lo utilizza come filamento guida per appaiarsi a tutti i trascritti target aventi una sequenza ad esso complementare e omologa. Così i siRnas si attaccano all'mRna bersaglio che viene degradato dalle endonucleasi.

Un aspetto che rende interessante questo meccanismo è che le molecole coinvolte possono agire anche nei confronti di molecole di mRna prodotte da specie di regni differenti, così che si sviluppa un meccanismo bidirezionale di interazione pianta-patogeno dove il patogeno utilizza queste molecole per invalidare il sistema immunitario della pianta ospite, e contemporaneamente la pianta utilizza esattamente lo stesso processo per silenziare i geni che sono coinvolti nella patogenicità e controllare così l'infezione. Anche Plasmopara viticola, la peronospora della vite, produce piccole molecole di Rna a doppio filamento (sRnas) come sistema di contrapposizione al meccanismo di difesa della vite che è a sua volta caratterizzato dalla produzione di sRnas rivolti contro geni di virulenza del patogeno. Inoltre, sono stati riscontrati due enzimi denominati dicer-like (DCL441 e DCL331) che processano l'RnaA a doppio filamento di P. viticola per formare i sRnas.

Partendo da questo meccanismo, da una collaborazione tra l'Università di Bologna e l'Università Politecnica delle Marche, sono stati sviluppati due costrutti di silenziamento genico, il costrutto 441 Pv-DCL441 hpRNA e il costrutto chimera Pv-DCL441+DCL331 hpRna, che codificano per due diversi costrutti a forcina che hanno come geni target le sequenze di P. viticola codificanti per una o entrambe le dicer-like proteins utili a processare le molecole di Rna adoppio filamento. Tali costrutti sono stati integrati tramite la tecnologia di trasformazione genetica mediata da due diversi ceppi di agrobacterium in alcuni genotipi di vite (Lambrusco Salamino, Kober 5BB, Thompson Seedless, Ancellotta), andando a realizzare durante il lavoro di tesi tre prove di trasformazione genetica, cui protocollo seguito si è differenziato in base al tipo di materiale vegetale sottoposto ad infezione, se ottenuto per organogenesi o per embriogenesi somatica.

Le prove di trasformazione genetica sono state utili a valutare l'efficienza di trasformazione delle due specie di agrobatterio utilizzate, A. tumefaciens ceppo EHA101 e un ceppo di tipo wild di A. rhizogenes. Dalle prove è risultata una maggiore efficienza alla trasformazione da parte di A. rhizogenes, valutata come la capacità di ottenere espianti esprimenti la Green fluorescent protein (Gfp) utilizzata come marcatore per identificare le cellule che hanno subito l'evento di trasformazione. La maggiore efficienza di A. rhizogenes lo rende potenzialmente interessante nell'applicazione delle tecniche di Dna ricombinante in vite, soprattutto per quei genotipi recalcitranti, però è necessario disarmarlo dai geni 'wild type' che determinano lo sviluppo di radici transgeniche dalla quale è difficile rigenerare un nuovo individuo.

Radice trasparente
Radice transgenica esprimente GFP sviluppatasi dai tessuti meristematici di Kober 5BB infettato con A. rhizogenes visualizzato alla sesta settimana dalla co-coltura sotto luce Uv con filtro Gfp
(Fonte: © Roberta Gravagno)

Altro elemento valutato è stato quello della predisposizione alla trasformazione dei quattro genotipi utilizzati. Thompson Seedless si è confermato essere il genotipo modello: sono state ottenute e selezionate sei linee transgeniche, tre per ogni costrutto, le quali rappresentano un notevole risultato che permetterà di verificare in seguito l'efficacia dei due costrutti nell'indurre resistenza stabile o meno a P. viticola in vite mediante il meccanismo di silenziamento genico. Se così fosse, si potrebbero realizzare ulteriori prove di trasformazione su altre cultivar con l'obiettivo di ottenere genotipi resistenti ad uno dei principali agenti patogeni causa di ingenti perdite economiche nel settore vitivinicolo, mantenendone però le principali caratteristiche che ne influenzano la qualità e riducendo le tempistiche che invece contraddistinguono il miglioramento genetico classico.

Germoglio
Germoglio putativamente transgenico di Thompson Seedless visualizzato alla quindicesima settimana dalla co-coltura sotto luce Uv con filtro Gfp
(Fonte: © Roberta Gravagno)

Infine, è stato valutato come il protocollo di rigenerazione adottato, se basato su organogenesi o su embriogenesi, influenzi la buona riuscita delle prove: l'utilizzo di embrioni somatici risulta interessante soprattutto per la riduzione di fenomeni di chimerismo data l'origine unicellulare del differenziamento, anche se è necessario ottimizzare il protocollo di trasformazione, mentre l'uso di ammassi meristematici assicura un'elevata efficienza di rigenerazione dei germogli.

Embrione
Embrione somatico di Ancellotta infettato con il ceppo EHA101 di A. tumefaciens visualizzato a 72 ore dalla co-coltura sotto luce Uv con filtro Gfp
(Fonte: © Roberta Gravagno)

Roberta Gravagno
Roberta Gravagno, categoria "Innovazione varietale e genomica"
(Fonte: © Roberta Gravagno)

Scarica la tesi completa di Roberta Gravagno
Per eventuali contatti: roberta.gravagno@hotmail.com

A cura di Roberta Gravagno

AgroInnovation Award è il premio di laurea istituito da Image Line in collaborazione con l'Accademia dei Georgofili al fine di promuovere la diffusione di approcci innovativi, strumenti digitali e l'utilizzo di internet in agricoltura.

AgroInnovation Award

Leggi le tesi vincitrici della quarta edizione.

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