Melo, tra genome editing e microRna

Miglioramento genetico per la resistenza al colpo di fuoco in cultivar suscettibili attraverso differenti approcci biotecnologici. Valerio Pompili è il vincitore dell'AgroInnovation Award 2020 nella categoria "Valorizzazione delle produzioni made in Italy" - tesi di dottorato

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Agroinnovation Award è il premio di laurea che promuove la diffusione di approcci innovativi, strumenti digitali e l'utilizzo di internet in agricoltura

In Italia, alcune tra le principali cultivar di melo attualmente in commercio, come Gala e Golden Delicious, sono suscettibili al colpo di fuoco causato dal batterio Erwinia amylovora. Ad oggi, la strategia più efficace per la gestione del colpo di fuoco è la produzione di cultivar di melo resistenti/tolleranti attraverso la manipolazione di uno o più geni della pianta, che sono associati alla resistenza o suscettibilità alla malattia. A riguardo, possono essere applicati sia il breeding convenzionale che l'ingegneria genetica. Tuttavia, mentre il breeding convenzionale è considerato un processo lungo e laborioso, le metodologie basate sull'ingegneria genetica rappresentano alternative rapide e precise per inserire il tratto desiderato nella specie di interesse.

In questa tesi di dottorato sono stati sfruttati differenti approcci biotecnologici da un lato per migliorare il tratto di resistenza al colpo di fuoco attraverso l'inattivazione di un gene di suscettibilità alla malattia e dall'altro per studiare un gene potenzialmente coinvolto nella resistenza della pianta.

In primo luogo, è stato sviluppato un sistema di editing genico basato su Crispr/Cas9-FLP/FRT, mediato da Agrobatterio tumefaciens, per inattivare il gene di suscettibilità al colpo di fuoco MdDIPM4 (Figura 1A) e generare cultivar di melo (Gala e Golden Delicious) con ridotta suscettibilità alla malattia e una minima traccia di Dna esogeno (Figura 1B). L'inattivazione di un gene di suscettibilità fondamentale per un'interazione pianta patogeno compatibile potrebbe essere considerata uno strumento rivoluzionario per produrre piante di melo resistenti alla malattia, poiché è più duratura se paragonata alle strategie basate sui geni di resistenza. Inoltre, la rimozione del T-Dna dalle piante editate con ridotta suscettibilità al patogeno permette anche di proteggere le piante da qualsiasi effetto dovuto alla presenza di un'endonucleasi esogena e, simultaneamente, di inserire ulteriori tratti di interesse attraverso trasformazioni geniche utilizzando lo stesso gene marker di selezione. Questa metodologia rappresenta quindi una strategia promettente e alternativa al breeding classico, specialmente per quelle specie di piante (come il melo) che richiedono lunghi tempi di maturazione e incrocio.
 
Figura 1. Rappresentazione schematica del sistema di editing genico Crispr/Cas9-FLP/FRT utilizzato per l'inattivazione del gene di suscettibilità a Erwinia amylovora MdDIPM4
(Fonte: © Valerio Pompili)

In secondo luogo, tramite analisi in silico, saggi istochimici e analisi di espressione genica, è stata studiata nella cultivar di melo Gala la regolazione trascrizionale del microRna MdmiR285N che è stato predetto svolgere un ruolo chiave nella regolazione post trascrizionale di 35 trascritti, tutti codificanti per differenti proteine di resistenza alla malattia (Figura 2). Questo lavoro fornisce informazioni di base riguardanti la regolazione trascrizionale di MdmiR285N e rappresenta una parte iniziale di uno studio a lungo termine focalizzato all'identificazione di un microRna ideale da impiegare nel miglioramento genetico del melo. A riguardo, poiché MdmiR285N è risultato coinvolto in diversi processi biologici quali la crescita della pianta, la riproduzione e la risposta a patogeni, una manipolazione mirata dei suoi livelli di espressione potrebbe rappresentare una strategia efficace per migliorare una grande varietà di tratti in melo.

Figura 2. Profilo regolatorio del microRna MdmiR285N sui suoi trascritti target di resistenza
(Fonte: © Valerio Pompili)

In parallelo, è stato condotto un lavoro metodologico basato su real time Pcr per la quantificazione del numero di copie del gene marker nptII e la caratterizzazione rapida e precisa delle piante transgeniche di melo prodotte. In melo, l'ingegneria genetica si basa principalmente sul trasferimento genico mediato da Agrobatterio tumefaciens e sull'uso di nptII come gene marker di selezione. In questo quadro, la quantificazione di nptII potrebbe avere differenti applicazioni quali stimare il numero di integrazioni del T-Dna, identificare piante chimeriche o determinare la rimozione del T-Dna in piante cisgeniche o editate sul genoma. Quest'ultima applicazione ha un grande impatto poiché le nuove tecnologie di breeding (cisgenesi ed editing genico) rappresentano uno degli strumenti più importanti per garantire in futuro un'agricoltura sostenibile.

Figura 3. Metodologia di Taqman RT-PCR per la quantificazione del gene nptII in melo e sue applicazioni
(Fonte: © Valerio Pompili)

In conclusione, questa ricerca ha prodotto cultivar di melo "élite" editate più tolleranti alla malattia del colpo di fuoco. Tuttavia ad oggi, in Europa, gli organismi ottenuti tramite mutagenesi (come anche l'editing genico) sono considerati Ogm secondo la Direttiva europea 2001/18/EC. Nel gennaio del 2019, un centinaio di centri di ricerca europei (universitari e istituti pubblici e privati) hanno firmato e inviato una lettera al presidente della Commissione europea sottolineando che regolamentare i prodotti del genome editing come Ogm avrà conseguenze altamente negative sull'agricoltura, società ed economia in Europa. Il mondo della ricerca sostiene infatti che la Direttiva possa essere modificata nella speranza che si possano adottare misure politiche adeguate a promuovere quelle tecnologie utili ad uno sviluppo sostenibile in agricoltura.

Inoltre, in questa tesi di dottorato sono state poste le basi per l'identificazione di un microRna chiave per la resistenza del melo a Erwinia amylovora. Tuttavia, ulteriori analisi sono necessarie per comprendere al meglio i meccanismi di regolazione di questo microRna sui suoi trascritti target e validare inoltre l'effettiva resistenza al patogeno in piante mutanti per tale microRna. Tali informazioni faciliteranno il disegno di una strategia adatta a ingegnerizzare il tratto desiderato con il minimo compromesso per la pianta.

Valerio Pompili
Valerio Pompili, categoria "Valorizzazione delle produzioni made in Italy"
(Fonte: © Valerio Pompili)

Scarica la tesi completa di Valerio Pompili
Per eventuali contatti: valerio.pompili@unito.it

A cura di Valerio Pompili

AgroInnovation Award è il premio di laurea istituito da Image Line in collaborazione con l'Accademia dei Georgofili al fine di promuovere la diffusione di approcci innovativi, strumenti digitali e l'utilizzo di internet in agricoltura.

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